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sulforafano è un phytochemical, una sostanza all'interno del gruppo di isotiocianato di composti organosulfur, trovato in verdure crocifere, come broccoli, cavoli, cavolfiori e cavolini di Bruxelles. Può anche essere trovato in bok choy, kale, cavoli, senape e crescione. Studi di ricerca hanno dimostrato che il sulforafano può aiutare a prevenire vari tipi di cancro entro il 2010 attivando la produzione di Nrf2, o fattore correlato al fattore nucleare eritroide 2, un fattore di trascrizione che regola i meccanismi antiossidanti protettivi che controllano la risposta della cellula agli ossidanti. Lo scopo del seguente articolo è descrivere la funzione del sulforafano.

Astratto

Il sistema antiossidante KEAP1-Nrf2-ARE è un mezzo principale con cui le cellule rispondono agli stress ossidativi e xenobiotici. Il sulforafano (SFN), un isotiocianato elettrofilo derivato da verdure crocifere, attiva la via KEAP1-Nrf2-ARE ed è diventato una molecola di interesse nel trattamento di malattie in cui lo stress ossidativo cronico svolge un ruolo etiologico importante. Dimostriamo qui che i mitocondri di cellule epiteliali della retina umana (RPE-1) in coltura trattate con SFN subiscono l'iperfusione che è indipendente sia da Nrf2 che dal suo inibitore citoplasmatico KEAP1. È stato riportato che la fusione mitocondriale è citoprotettiva inibendo la formazione dei pori nei mitocondri durante l'apoptosi e, coerentemente con questo, mostriamo la citoprotezione indipendente da Nrf2, delle cellule trattate con SFN esposte all'induatore-apoptosi, staurosporina. Meccanicamente, l'SFN attenua il reclutamento e / o la ritenzione del fattore di fissione solubile Drp1 nei mitocondri e nei perossisomi, ma non influenza l'abbondanza complessiva di Drp1. Questi dati dimostrano che le proprietà benefiche di SFN si estendono oltre l'attivazione del sistema KEAP1-Nrf2-ARE e garantiscono ulteriori interrogazioni dato l'uso corrente di questo agente in più studi clinici.

parole chiave: Sulforaphane, Nrf2, Drp1, Mitocondri, Fissione, Fusione, Apoptosi

Introduzione

Sulforaphane è un inibitore indipendente di Nrf2 della fissione mitocondriale

Il sulforafano (SFN) è un composto di isotiocianato derivato dalla dieta più comunemente dalle verdure crocifere [56]. È generato nelle piante come risposta xenobiotica alla predazione tramite rilascio vescicolare dell'enzima idrolitico mirosinasi dalle cellule danneggiate; questo enzima converte i glucosinolati in isotiocianati [42]. Negli ultimi due decenni, SFN è stato ampiamente caratterizzato per le sue proprietà antitumorali, antiossidanti e antimicrobiche segnalate [57]. Gran parte di questa efficacia è stata attribuita alla capacità di SFN di modulare la via di segnalazione dell'elemento di risposta antiossidante (ARE) di KEAP1-Nrf2, sebbene siano state identificate attività aggiuntive del composto, inclusa l'inibizione dell'attività dell'istone deacetilasi e la progressione del ciclo cellulare [ 29]. Nrf2 è il principale fattore di trascrizione antiossidante e in condizioni di omeostasi, la sua stabilità è soppressa attraverso l'azione del complesso citoplasmatico Cullin3KEAP1 ubiquitin ligasi [20]. Nello specifico, Nrf2 viene assunto nella ligasi Cullin3KEAP1 legandosi all'adattatore di substrato dimerico KEAP1 e successivamente modificato con catene polyUb che mirano al fattore di trascrizione per la degradazione mediata dal proteasoma. Questo ricambio costitutivo limita l'emivita di Nrf2 nelle celle non accentate a ~ 15 min [30], [33], [46], [55]. In risposta a numerosi tipi di stress, in particolare lo stress ossidativo, KEAP1, una proteina ricca di cisteina, agisce come un sensore redox e la modificazione ossidativa delle cisteine ​​critiche, in particolare C151, di KEAP1 dissocia Nrf2-KEAP1 da CUL3 prevenendo così la degradazione di Nrf2 [ 8], [20], [55]. In particolare, SFN, e possibilmente altri attivatori Nrf2, imitano lo stress ossidativo modificando C151 di KEAP1 ad esempio [21]. La stabilizzazione di Nrf2 consente la sua traslocazione nel nucleo in cui induce l'espressione di una batteria di geni antiossidanti di fase II e di disintossicazione. Nrf2 si lega agli elementi promotori della risposta antiossidante (ARE) dei suoi geni bersaglio affini attraverso l'eterodimerizzazione con piccole proteine ​​Maf [19]. Questo sistema presenta una risposta dinamica e sensibile agli antiossidanti indiretti come l'SFN, i radicali liberi generati dai mitocondri [16], o altre fonti fisiologiche di stress ossidativo [41].

I mitocondri sono organelli subcellulari dinamici che regolano una serie di funzioni cellulari che vanno dalla produzione di ATP e tampone del calcio intracellulare alla regolazione redox e all'apoptosi [13], [49]. I mitocondri rappresentano anche la principale fonte di specie reattive dell'ossigeno (ROS) all'interno della cellula. È quindi necessaria una corretta regolazione della funzione mitocondriale per ottimizzare la produzione di ATP per soddisfare le esigenze cellulari riducendo al contempo al contempo gli effetti potenzialmente dannosi dell'eccessiva produzione di radicali liberi. Un requisito critico per la modulazione fine della funzione mitocondriale è la capacità dei mitocondri di funzionare sia come macchine biochimiche sia come parte di una vasta rete reattiva.

La morfologia e la funzione della rete mitocondriale sono determinate da un equilibrio regolato tra fissione e fusione. La fissione mitocondriale è necessaria per l'ereditarietà cellulare dei mitocondri durante la divisione cellulare [28] e per la degradazione autofagica selettiva di mitocondri depolarizzati o danneggiati, denominati mitophagy [1]. Al contrario, è necessaria la fusione per la complementazione dei genomi mitocondriali e la condivisione delle componenti della catena di trasporto degli elettroni tra i mitocondri vicini [54]. A livello molecolare, la fissione mitocondriale e la fusione sono regolate da grandi GTPasi di tipo dynaminico. Tre enzimi regolano principalmente la fusione: Mitofusins ​​1 e 2 (Mfn1 / 2) sono proteine ​​di membrana esterna a due passaggi che mediano la fusione della membrana esterna tramite interazioni eterotipiche tra i mitocondri adiacenti [15], [25], [37], mentre OPA1 è un interno proteina di membrana che assicura simultaneamente la connettività della matrice regolando la fusione delle membrane interne [5]. L'attività GTPase di tutte e tre le proteine ​​è necessaria per la fusione robusta [5], [18] e OPA1 è ulteriormente regolato dalla proteolisi complessa all'interno della membrana mitocondriale da parte delle proteasi OMA1 [14], PARL [6] e YME1L [45 ]. È importante sottolineare che il potenziale di membrana mitocondriale intatto è necessario per una fusione efficiente al fine di sopprimere l'integrazione di mitocondri danneggiati e sani [26].

La fissione mitocondriale è principalmente catalizzata da una proteina citosolica chiamata proteina 1 correlata alla Dynamin (Drp1 / DNM1L). Drp1 è reclutato dal citosol a siti prospettici di fissione sulla membrana esterna mitocondriale [43]. I principali recettori per Drp1 sulla membrana esterna sono il fattore di fissione mitocondriale (Mff) [32] e, in misura minore, Fission 1 (Fis1) [51]. Inoltre, è stato scoperto un recettore dell'esca, MIEF1 / MiD51, che agisce per limitare ulteriormente l'attività della proteina Drp1 in potenziali siti di fissione [58]. Una volta ancorata alla membrana mitocondriale esterna, Drp1 si oligomerizza in strutture a spirale attorno al corpo del mitocondrio e quindi utilizza l'energia derivata dall'idrolisi GTP per mediare la scissione fisica delle membrane mitocondriali esterne e interne [17]. I tubuli derivati ​​dal reticolo endoplasmatico agiscono come un costrittore iniziale dei mitocondri prima dell'oligomerizzazione di Drp1, sottolineando la rivelazione che i mitocondri non ristretti sono più ampi della circonferenza permissiva di una spirale di Drp1 completata [12]. La dinamica dell'actina è anche importante per le interazioni ER-mitocondrio che precedono la fissione mitocondriale [24]. Oltre al suo ruolo nella fissione mitocondriale, Drp1 catalizza la fissione dei perossisomi [40].

Drp1 è molto simile alla ben definita proteina dynamin in quanto entrambe le proteine ​​contengono un dominio GTPase N-terminale, un dominio centrale che è critico per l'auto-oligomerizzazione e un dominio effector GTPase C-terminale [31]. Drp1 raggiunge la selettività per le membrane mitocondriali attraverso una combinazione di interazioni con le sue proteine ​​recettoriali Mff e Fis1 e anche attraverso la sua affinità per la cardiolipina fosfolipidica specifica dei mitocondri attraverso l'esclusivo dominio B-insert di Drp1 [2]. Drp1 esiste tipicamente come un omotetramero nel citoplasma e l'ordine superiore nei siti di fissione mitocondriale è mediato dal dominio centrale di Drp1 [3].

Dato il legame implicito tra la funzione mitocondriale e il percorso di KEAP1-Nrf2-ARE, abbiamo studiato gli effetti dell'attivazione di Nrf2 sulla struttura e la funzione mitocondriale. Dimostriamo qui che SFN induce l'iperfusione mitocondriale che, inaspettatamente, è indipendente da Nrf2 e KEAP1. Questo effetto di SFN avviene attraverso un'inibizione della funzione Drp1. Dimostriamo inoltre che SFN conferisce resistenza all'apoptosi che è Nrf2-indipendente e imita quello osservato nelle cellule impoverito di Drp1. Questi dati indicano collettivamente che oltre a stabilizzare e attivare Nrf2, SFN modula la dinamica mitocondriale e preserva il fitness e la sopravvivenza cellulare.

Risultati

Sulforaphane induce Nrf2 / Iperfusione indipendente di KEAP1 dei mitocondri

Nel corso dello studio degli effetti dell'attivazione di Nrf2 sulle dinamiche della rete mitocondriale, abbiamo scoperto che il trattamento delle cellule epiteliali del pigmento retinico umano immortalate (RPE-1) con sulforafano (SFN), un potente attivatore della segnalazione Nrf2, ha indotto una robusta fusione di la rete mitocondriale rispetto alle cellule di controllo trattate con veicolo (Fig. 1A e B). La morfologia dei mitocondri in queste cellule somigliava molto a quella dei mitocondri nelle cellule impoverite da siRNA di Drp1 endogeno, il principale fattore di fissione mitocondriale (Fig. 1A). Questo risultato ha sollevato l'idea intrigante che la fissione mitocondriale e lo stato di fusione rispondano direttamente ai livelli di Nrf2 nella cellula. Tuttavia, la stimolazione delle cellule con altri stabilizzatori e attivatori Nrf2 come l'inibitore del proteasoma MG132, il pro-ossidante tBHQ o il knockdown dell'inibitore Nrf2 KEAP1 non ha indotto la fusione mitocondriale (Fig. 1A e B). La stabilizzazione di Nrf2 da queste manipolazioni è stata confermata dal western blotting per Nrf2 endogeno (Fig. 1C). Inoltre, l'espressione di Nrf2 era superflua per la fusione mitocondriale indotta da SFN, poiché l'abbattimento di Nrf2 endogeno con siRNA non è riuscito a contrastare questo fenotipo (Fig. 1D F). Poiché SFN stimola la via KEAP1-Nrf2-ARE modificando covalentemente i residui di cisteina di KEAP1 [21], abbiamo abbattuto KEAP1 per stabilire se l'iperfusione mitocondriale indotta da SFN è stimolata attraverso un percorso dipendente da KEAP1, ma Nrf2 indipendente. Tuttavia, anche l'esaurimento di KEAP1 non è riuscito ad abrogare la fusione mitocondriale indotta da SFN (Fig. 1G I). Infatti, SFN ha invertito la morfologia della pro-fissione indotta dall'esaurimento di KEAP1 (Fig. 1G, pannello b contro pannello d). Questi risultati indicano che il trattamento SFN causa la fusione mitocondriale indipendente dal percorso canonico KEAP1-Nrf2-ARE e ci ha portato a interrogare se SFN influenza direttamente i componenti della fissione mitocondriale o del macchinario di fusione.

Figura 1 SFN induce la fusione mitocondriale indipendente da Nrf2 / KEAP1. (A) Le cellule RPE-1 sono state trasfettate con gli siRNA indicati e 3 giorni dopo sono state trattate con DMSO o gli attivatori Nrf2 SFN (50? M), MG132 (10? M) o tBHQ (100? M) per 4 ore. I mitocondri (rossi) sono etichettati con un anticorpo anti-Tom20 e i nuclei (blu) sono controcolorati con DAPI. (B) Grafico che mostra la quantificazione del punteggio morfologico mitocondriale da (A). > 50 cellule per condizione sono state valutate in cieco. (C) Western blot rappresentativi da (A). (D) Le cellule RPE-1 sono state trasfettate con siRNA 10 nM e 3 giorni dopo sono state trattate con SFN per 4 ore prima di essere fissate e colorate come in (A). (E) Grafico che mostra la quantificazione del punteggio del fenotipo mitocondriale da (D). > 100 cellule per condizione sono state valutate in cieco. (F) Western blot rappresentativi da (D). (G) Le cellule sono state trasfettate e trattate come in (D) con siCON o siKEAP1. (H) Le cellule da (G) sono state valutate come in (B) ed (E) sulla base della morfologia mitocondriale. (I) Western blot rappresentativi da (G). I dati in (B), (E) e (H) sono stati compilati da 3 esperimenti indipendenti ciascuno e la significatività statistica è stata determinata dal test t di Student a due code. Le barre di errore riflettono +/- SD (per l'interpretazione dei riferimenti al colore nella legenda di questa figura, si rimanda il lettore alla versione web di questo articolo).

Sulforaphane danneggia l'associazione mitocondriale di Drp1

Sulla base del riscontro che il trattamento con SFN induce l'iperfusione mitocondriale, abbiamo ipotizzato che questo fenotipo fosse o una conseguenza dell'eccessiva attività di fusione o di un'inibizione dell'attività della fissione. Per discriminare tra queste due possibilità, abbiamo confrontato la morfologia dei perossisomi in presenza e assenza di SFN. I perossisomi sono simili ai mitocondri in quanto sono organelli dinamici la cui forma e lunghezza sono costantemente in flusso [44]. I perossisomi contengono sia Fis1 che Mff nella loro membrana esterna e, di conseguenza, sono bersagli per la fissione mediata da Drp1 [22], [23]. Tuttavia, i perossisomi non utilizzano il meccanismo di fusione della rete mitocondriale e, di conseguenza, non subiscono la fusione [39]. Piuttosto, la fissione perossisomale è contrastata dall'allungamento dei perossisomi esistenti attraverso l'aggiunta de novo di membrane e proteine ​​[44]. Poiché ai perossisomi manca Mfn1 / 2 e OPA1, abbiamo pensato che se SFN attivasse il meccanismo di fusione invece di inibire il meccanismo di fissione, la lunghezza del perossisoma non ne risentirebbe. Nelle cellule trattate con veicoli, i perossisomi vengono mantenuti come organuli brevi, rotondi e puntiformi (Fig. 2, pannelli b e d). Tuttavia, il trattamento con SFN ha aumentato la lunghezza del perossisoma di ~ 2-fold rispetto alle cellule di controllo (Fig. 2, pannelli f e h). Inoltre, molti dei perossisomi sono stati pizzicati vicino al centro, indicando un potenziale difetto di scissione (Fig. 2, pannello h, punte di freccia). Allo stesso modo, i perossisomi nelle cellule trasfettate con DrP1 siRNA erano anormalmente lunghi (Fig. 2, pannelli j e l), confermando che Drp1 è richiesto per la fissione perossisomale e suggerendo che il trattamento con SFN provoca fenotipi mitocondriali e perossisomali interrompendo il meccanismo di fissione.

La figura 2 SFN induce l'allungamento perossisomiale. (A) Le cellule RPE-1 sono state trasfettate con 10 nM del siRNA indicato e 3 giorni dopo sono state trattate con DMSO o 50? M SFN per 4 ore. I perossisomi (verdi) sono stati marcati con un anticorpo anti-PMP70, i mitocondri con MitoTracker (rosso) e il DNA controcolorato con DAPI. Gli inserti ingranditi dei perossisomi sono mostrati sulla destra (pannelli d, h e l) per facilitare la visualizzazione dei cambiamenti nella morfologia indotti dall'esaurimento di SFN e Drp1. Le punte delle frecce evidenziano i punti di costrizione. (Per l'interpretazione dei riferimenti al colore nella legenda di questa figura, si rimanda il lettore alla versione web di questo articolo).

Successivamente abbiamo determinato in che modo SFN limita la funzione Drp1. Le possibilità includevano riduzioni dei livelli di espressione, reclutamento / ritenzione ai mitocondri, oligomerizzazione o attività enzimatica della GTPasi. Un deficit in uno qualsiasi di questi comporterebbe una ridotta fissione e iperfusione mitocondriale. Non abbiamo rilevato cambiamenti riproducibili nei livelli di proteina Drp1 dopo il trattamento con SFN (Fig. 1C e 3A), e quindi abbiamo concluso che SFN non altera la stabilità o l'espressione di Drp1, coerente con Drp1 che ha un'emivita> 10 h [50] ei nostri trattamenti SFN sono di durata inferiore. Successivamente, abbiamo studiato se SFN ha influenzato il reclutamento o la ritenzione di Drp1 nei mitocondri. Studi di frazionamento hanno mostrato che SFN ha indotto una perdita di Drp1 dalla frazione mitocondriale (Fig. 3A, corsie 7 e Fig. 8B). Come riportato in precedenza [3], solo una frazione minore di Drp43 (~ 1%) è associata alla rete mitocondriale in un dato momento durante condizioni di stato stazionario con la maggior parte dell'enzima residente nel citoplasma (Fig. 3A, corsie 3 5 ). Questi dati di frazionamento sono stati confermati utilizzando l'analisi di co-localizzazione che ha mostrato una riduzione di ~ 8% nei focolai Drp40 puntati e localizzati nei mitocondri dopo il trattamento con SFN (Fig. 1C e D). Insieme, questi dati indicano che la fusione mitocondriale indotta da SFN è, almeno in parte, dovuta all'associazione attenuata di Drp3 con i mitocondri. I nostri dati non distinguono se SFN interferisce con il reclutamento mitocondriale rispetto alla ritenzione mitocondriale di Drp1, o entrambi, poiché l'analisi del Drp1 endogeno non era suscettibile di visualizzare la GTPasi mediante microscopia a cellule vive.

La figura 3 SFN causa una perdita di Drp1 dai mitocondri. (A) Frazionamento subcellulare di cellule RPE-1 dopo 4 h di DMSO o SFN. I lisati di cellule intere (WCL), nucleari (Nuc), citosolici (Cyto) e frazioni mitocondriali (Mito) sono stati risolti mediante SDS-PAGE e trattati per western blotting con gli anticorpi indicati. La migrazione dei marcatori di peso molecolare è indicata a sinistra. (B) Grafici che mostrano la quantificazione densitometrica di Drp1 nelle frazioni indicate da (A). (C) Le cellule RPE-1 sono state transfettate con 10 nM siCON o siDrp1 e 3 giorni dopo trattati con DMSO o SFN per 4 h. Drp1 (verde) è stato visualizzato con un anticorpo anti-Drp1, mitocondri con MitoTracker (rosso) e nuclei con DAPI (blu). (D) Analisi di co-localizzazione automatica di Drp1 e segnale MitoTracker da (C). I dati in (B) e (D) sono stati compilati dagli esperimenti indipendenti 3 e 5, rispettivamente, e la significatività statistica è stata determinata dal test t di Student a due code. Le barre di errore si riflettono +/- SD e gli asterischi indicano la significatività statistica. (Per l'interpretazione dei riferimenti al colore in questa legenda figura, il lettore è riferito alla versione web di questo articolo).

Sulforaphane conferisce protezione contro l'apoptosi indotta da Staurosportina Indipendente da Nrf2

Lavori precedenti hanno dimostrato che la fissione mitocondriale è permissiva nella formazione dei pori nella membrana mitocondriale esterna generata da Bax / Bak durante l'apoptosi [11]. Drp1 ha dimostrato di essere reclutato selettivamente nei mitocondri durante l'apoptosi [11] e, coerentemente con questo, mitocondri frammentati sono stati osservati all'inizio del processo [27]. Al contrario, si ritiene che l'inibizione della fissione mitocondriale inibisca l'apoptosi bloccando la formazione dei pori della membrana esterna che consentono il rilascio del citocromo c [53]. Di conseguenza, la stimolazione della fusione mitocondriale ritarda la progressione dell'apoptosi indotta da composti tra cui la staurosporina (STS) [14]. Per determinare se SFN protegge le cellule RPE-1 dall'apoptosi mediata da STS e, in tal caso, se ciò richiede Nrf2, abbiamo stabilito un saggio per indurre prontamente la scissione della poli ADP ribosio polimerasi (PARP), un substrato di caspasi-3 attivata e marcatore definitivo di apoptosi. Il trattamento delle cellule RPE-1 con STS 1 M per 6 h ha causato solo una scissione molto modesta di PARP, ma ciò è stato prevenuto dal co-trattamento SFN (ad esempio, Fig. 4A, corsia 3 contro 4). Per aumentare la robustezza di questo test, abbiamo ulteriormente sensibilizzato le cellule all'apoptosi indotta da STS pretrattandole con siRNA mirato al fattore anti-apoptotico, Bcl-XL. Questo pretrattamento ha ridotto l'espressione di Bcl-XL e ha promosso notevolmente la scissione PARP in funzione del tempo esposto a STS (Fig. 4B, confrontare la corsia 2 con le corsie 4-10). È importante sottolineare che 2 ore di pretrattamento con SFN hanno mitigato la scissione di PARP nelle cellule esposte a STS (Fig. 4C, corsia 3 contro 4 e corsia 5 contro 6). Allo stesso modo, le cellule stabilmente impoverite di Nrf2 da CRISPR / Cas9 sono state protette in modo comparabile dalla tossicità STS dal pretrattamento SFN (Fig. 4C, corsia 11 contro 12 e corsia 13 contro 14 e Fig. 4D). Questa protezione è stata osservata utilizzando sia la scissione PARP (Fig. 4C e D) che la morfologia cellulare (Fig. 4E) come letture. L'efficacia dell'esaurimento di Nrf2 da parte di CRISPR / Cas9 è stata confermata mediante western blotting (Fig. 4C, Nrf2 blot). Come previsto, le cellule di deplezione di Drp1, che produce anche un fenotipo di iperfusione (Fig. 1A), hanno anche bloccato la scissione di PARP in risposta a STS rispetto alle cellule di controllo incubate con SFN (Fig. 4F e G). Insieme, questi risultati sono coerenti con SFN che conferisce protezione contro l'apoptosi attraverso la sua capacità di limitare la funzione di Drp1, indipendentemente dalla stabilizzazione e attivazione di Nrf2.

Figura 4 Gli effetti citoprotettivi di SFN sono indipendenti dall'espressione di Nrf2 (A) Le cellule RPE-1 sono state pretrattate con DMSO o 50? M SFN per 2 ore prima del trattamento con DMSO, 1? M staurosporina (STS) o 50? M etoposide per 6 ore e sono stati processati per western blotting anti-PARP. (B) Le cellule RPE-1 sono state trasfettate con 2.5 nM siCON, 1 nM siBcl-XL o 2.5 nM siBcl-XL e 3 giorni dopo sono state trattate con DMSO o 1? M STS per 2, 4 o 6 ore. Vengono mostrati i western blot rappresentativi e la migrazione dei marcatori di peso molecolare è indicata a sinistra. (C) Le cellule RPE-9 generate da CRISPR / Cas2 (Nrf2WT) e knockout Nrf2 (Nrf1KO) sono state trasfettate con 1 nM siBcl-XL e 3 giorni dopo sono state pretrattate con DMSO o 50? M SFN per 2 ore . Successivamente, le cellule sono state trattate con 1? M STS per 2, 4 o 6 ore. Vengono mostrati i western blot rappresentativi con gli anticorpi indicati. (D) Quantificazione del PARP scisso come percentuale del PARP totale (scisso + non tagliato) da 3 esperimenti indipendenti. È importante sottolineare che i livelli di PARP scissa erano comparabili indipendentemente dal fatto che le cellule esprimessero Nrf2 o meno, indicando che la protezione SFN da STS è indipendente dal fattore di trascrizione. (E) Immagini a contrasto di fase 20X scattate immediatamente prima della raccolta dei lisati da (C). Barra della scala = 65 m. (F) Western blot rappresentativi che dimostrano che l'esaurimento di Drp1 conferisce una protezione quasi comparabile da STS come trattamento SFN. Le cellule RPE-1 sono state trasfettate con siBcl-XL da 1 nM e inoltre trasfettate con siCON da 10 nM o siDrp10 da 1 nM. 3 giorni dopo, le cellule siCON sono state pretrattate con SFN come in (A) e (C) e quindi esposte a STS per 4 ore prima di essere raccolte e processate per il western blot con gli anticorpi indicati. (G) Uguale a (D) per i dati presentati in (F) compilati da 3 esperimenti indipendenti. Le barre di errore riflettono +/- SEM

Discussione

Abbiamo scoperto che SFN modula la dinamica di fissione / fusione mitocondriale indipendentemente dai suoi effetti sulla via KEAP1-Nrf2-ARE. Questo è intrigante a causa di un presunto legame tra disfunzione mitocondriale e produzione di ROS e la necessità di squelchare i radicali liberi derivati ​​dai mitocondri attraverso l'attivazione di Nrf2. Questo ulteriore impatto funzionale di SFN è di potenziale importanza dato il numero di studi clinici 30 attualmente in corso per testare SFN per il trattamento di una varietà di malattie tra cui il cancro alla prostata, la broncopneumopatia ostruttiva e l'anemia falciforme [7], [10], [ 47].

Poiché SFN è un isotiocianato [56] e attiva la segnalazione Nrf2 mediante acilazione diretta delle cisteine ​​KEAP1 critiche per sopprimere la degradazione Nrf2 [21], ne consegue che SFN esercita i suoi effetti pro-fusione modulando l'attività di un fattore di fissione o fusione tramite la modificazione della cisteina . I nostri dati sostengono fortemente che Drp1 è regolato negativamente da SFN, anche se resta da chiarire se GTPase sia un obiettivo diretto di acilazione. Nonostante questo divario di conoscenze, la funzione di Drp1 è chiaramente compromessa dall'SFN in quanto sia i mitocondri che i perossisomi diventano iperfusi in risposta al trattamento con SFN e questi organelli condividono Drp1 per i rispettivi eventi di scissione [38]. Inoltre, l'SFN riduce la quantità di Drp1 che si localizza e si accumula nei mitocondri (Fig. 3). Poiché i nostri esperimenti sono stati condotti con tutte le proteine ​​endogene, la nostra scoperta di Drp1 nei siti di fissione mitocondriale è in condizioni di stato stazionario e, di conseguenza, non possiamo distinguere tra un reclutamento e un difetto di ritenzione dell'enzima causato da SFN. Inoltre, non possiamo eliminare la possibilità che gli SFN acilino un recettore ai mitocondri (Fis1 o Mff) per bloccare il reclutamento di Drp1, sospettiamo che Drp1 sia stato modificato direttamente. Drp1 ha nove cisteine, otto delle quali risiedono nel dominio centrale richiesto per l'oligomerizzazione [3], e una delle quali risiede nel dominio GTPase Effector (GED) al C-terminale di Drp1. L'acilazione diretta di una qualsiasi di queste cisteine ​​potrebbe causare un difetto di attività in Drp1 e quindi essere alla base dell'effetto di SFN sulla dinamica mitocondriale. In particolare, il lavoro precedente suggerisce che i difetti nell'oligomerizzazione e l'attività catalitica possono abrogare la ritenzione di Drp1 nei mitocondri [52]. Cys644 nel dominio GED è un obiettivo particolarmente attraente basato su un lavoro precedente che mostra la mutazione di queste mutazioni di cisteina che alterano l'attività di Drp1 GTPase [4] e che questa particolare cisteina è modificata da elettrofili reattivi al tiolo [9]. La risoluzione di questa domanda in sospeso richiederà la convalida spettrometrica di massa. In sintesi, abbiamo identificato una nuova funzione citoprotettiva per il composto SFN clinicamente rilevante. Oltre ad attivare il principale fattore di trascrizione antiossidante Nrf2, SFN promuove la fusione mitocondriale e perossisomale e questo effetto è indipendente da Nrf2. Il meccanismo alla base di questo fenomeno comporta una riduzione della funzione della GTPasi Drp1, il mediatore primario della fissione mitocondriale e perossisomale. Una delle principali conseguenze della fusione mitocondriale mediata da SFN è che le cellule diventano resistenti agli effetti tossici dell'induttore di apoptosi staurosporina. Questa ulteriore azione citoprotettiva di SFN potrebbe essere di particolare utilità clinica nelle numerose malattie neurodegenerative per le quali l'età è il principale fattore di rischio (ad esempio, morbo di Parkinson, morbo di Alzheimer, degenerazione maculare legata all'età) poiché tali malattie sono state associate all'apoptosi e ridotto livelli e / o disregolazione di Nrf2 [35], [36], [48].

Materiali e Metodi

Saggi di apoptosi

Le cellule sono state seminate e trasfettate con siRNA come indicato di seguito. Le cellule sono state pretrattate con 50 µM di sulforafano per 2 h per indurre la fusione mitocondriale e poi sono state trattate con 1 µM di staurosporina per indurre l'apoptosi. Al momento della raccolta, i terreni sono stati raccolti in singole provette e sottoposti a centrifugazione ad alta velocità per ottenere cellule apoptotiche a pellet. Questo pellet cellulare è stato combinato con cellule aderenti e solubilizzato in tampone Laemmli concentrato 2 volte. I campioni sono stati sottoposti a western blot anti-PARP.

Generazione di costruzione CRISPR / Cas9

Per creare LentiCRISPR / eCas9 1.1, LentiCRISPR v2 (aggiunta #52961) è stato dapprima tagliato con Age1 e BamH1. Successivamente, SpCas9 da eSpCas9 1.1 (addgene #71814) è stato amplificato con PCR amplificato con Age1 e BamH1 utilizzando i seguenti primer (avanti AGCGCACCGGTTCTAGAGCGCTGCCACCATGGACTATAAGGACCACGAC, Reverse AAGCGCGGATCCCTTTTTCTTTTTTGCCTGGCCGG) e ligato nel vettore di taglio sopra. sequenze di sgRNA sono state determinate utilizzando Benchling.com. I parametri sono stati impostati per indirizzare la sequenza di codifica con il punteggio più alto sul bersaglio e il più basso fuori bersaglio. Le seguenti sequenze (sequenza target sottolineata, hs sgNFE2L2 # 1 senso CACCGCGACGGAAAGAGTATGAGC, antisenso AAACGCTCATACTCTTTCCGTCGC; hs sgNFE2L2 # 2 senso CACCGGTTTCTGACTGGATGTGCT, antisenso AAACAGCACATCCAGTCAGAAACC; hs sgNFE2L2 # 3 senso CACCGGAGTAGTTGGCAGATCCAC, antisenso AAACGTGGATCTGCCAACTACTCC) sono stati ricotto e ligati in BsmB1 tagliato LentiCRISPR / eCas9 1.1. Le cellule RPE-1 infettate con lentivirus sono state selezionate con puromicina e mantenute come una popolazione aggregata. Knockout è stato confermato da immunofluorescenza e western blotting.

Coltura cellulare e trasfezione

Cellule epiteliali pigmentate retiniche umane trasformate con telomerasi (RPE-1) (ATCC) sono state coltivate in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) contenente 1 g / L di glucosio integrato con penicillina, streptomicina, cocktail di amminoacidi non essenziali 1X (Life Technologies), e 10% di siero bovino fetale (Life Technologies). Per le trasfezioni di siRNA, 30,000 35,000 cellule / mL sono state seminate durante la notte. Le cellule hanno ricevuto 10 nM di siRNA diluito in DMEM privo di siero e combinato con il reagente di trasfezione dell'interferina allo 0.3% (PolyPlus). Per la sensibilizzazione all'apoptosi, le cellule hanno ricevuto siRNA Bcl-XL da 1 nM. Le cellule sono state raccolte 2-3 giorni dopo la trasfezione.

Prodotti chimici, anticorpi e siRNA Oligos

Anticorpi contro? -Tubulina (Segnalazione cellulare),? -Tubulina (Sigma), Drp1 (BD Biosciences), KEAP1 (Proteintech), Lamin B1 (Abcam), PARP (Segnalazione cellulare), PMP70 (Abcam) e Tom20 (BD Biosciences ) sono stati usati a diluizioni 1: 1000 per il western blotting e per l'immunofluorescenza. In-house, l'anticorpo di coniglio anti-Nrf2 è stato utilizzato a 1: 2000 per il western blotting [34], [59]. Sulforafano (Sigma) e staurosporina (Tocris) sono stati utilizzati rispettivamente a 50 µM e 1 µM. siRNA contro Drp1 (Dharmacon), Nrf2 (Dharmacon), KEAP1 (Segnalazione cellulare) e Bcl-XL (Segnalazione cellulare) sono stati utilizzati a 10 nM se non diversamente specificato.

Immunofluorescenza e in Vivo Labeling

Le cellule seminate su coprioggetti di vetro da 18 mm sono state trattate con veicolo o farmaco, fissate in formaldeide al 3.7% e quindi permeabilizzate in Triton X-0.2 / PBS allo 100% su ghiaccio per 10 min. Gli anticorpi primari sono stati incubati in albumina sierica bovina al 3% (BSA) in PBS per una notte a 4 ° C. Dopo i lavaggi PBS, le cellule sono state incubate per 1 ora in anticorpi secondari coniugati Alexa488- o Alexa546- adatti alla specie (diluiti 1: 1000) e 0.1 μg / mL DAPI (Sigma) in 3% BSA / PBS. I mitocondri sono stati visualizzati mediante immunofluorescenza anti-Tom20 o incubando cellule in 200 nM MitoTracker Red CMXRos (Molecular Probes, Inc.) in DMEM senza siero per 30 min a 37 ° C prima della fissazione.

Microscopia e analisi delle immagini

I campioni di immunofluorescenza sono stati visualizzati su un microscopio confocale LSM710 (Carl Zeiss). Le micrografie sono state acquisite utilizzando obiettivi a immersione in olio 63X o 100X e le immagini sono state regolate e migliorate utilizzando Adobe Photoshop CS6. L'analisi di co-localizzazione è stata eseguita utilizzando la funzione di co-localizzazione Carl Zeiss LSM710 con soglie impostate manualmente mentre non si conosceva l'identità dei campioni. Le barre della scala in tutto, se non diversamente indicato, sono 10 m. La morfologia mitocondriale è stata valutata mediante punteggio in cieco. Se i mitocondri di una cellula erano mantenuti come puncta multipli, rotondi, discriminanti, la cellula veniva valutata come "fissazione". Se i singoli mitocondri erano indistinguibili e l'intera rete mitocondriale appariva continua, la cellula veniva classificata come "fusione". Tutte le altre cellule, comprese quelle con mitocondri in cluster, sono state classificate come "intermedie".

Frazionamenti subcellulari

Le cellule RPE-1 sono state coltivate fino alla confluenza. Dopo un lavaggio con PBS, le cellule sono state sottoposte a centrifugazione a 600 g per 10 min e risospese in tampone di isolamento 600 μl (mannitolo 210 mM, saccarosio 70 mM, MOPS 5 mM, EDTA 1 mM pH 7.4 + PMSF 1 mM). La sospensione è stata lisata 30 volte in un omogeneizzatore Dounce. Una frazione dell'omogenato è stata conservata come "lisato cellulare intero". Il resto è stato sottoposto a centrifugazione a 800 g per 10 min sui nuclei del pellet. I surnatanti sono stati sottoposti a centrifugazione a 1500 g per 10 min per eliminare i nuclei rimanenti e le cellule non lisate. Questo supernatante è stato sottoposto a centrifugazione a 15,000 g per 15 min in mitocondri a pellet. Il surnatante è stato conservato come la `` frazione citosolica ''. Il pellet è stato lavato delicatamente con PBS e risospeso in tampone di isolamento. La concentrazione proteica di ciascuna frazione è stata misurata mediante saggio di acido bicinconinico (BCA) e quantità equivalenti di proteine ​​sono state risolte mediante SDS-PAGE.

Macchia occidentale

Le cellule sono state lavate in PBS e solubilizzate in tampone solubilizzante Laemmli concentrato 2 volte (100 mM Tris [pH 6.8], 2% SDS, 0.008% blu di bromofenolo, 2% 2-mercaptoetanolo, 26.3% glicerolo e 0.001% pirinina Y). I lisati sono stati fatti bollire per 5 minuti prima del caricamento su gel di poliacrilammide di sodio dodecil solfato (SDS). Le proteine ​​sono state trasferite alle membrane di nitrocellulosa e le membrane sono state bloccate per 1 ora in 5% di latte / TBST. Gli anticorpi primari sono stati diluiti in 5% di latte / TBST e incubati con il blot per una notte a 4 ° C. Gli anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano (HRP) sono stati diluiti in 5% di latte / TBST. Le macchie sono state elaborate con chemiluminescenza potenziata e le quantificazioni densitometriche sono state eseguite utilizzando il software ImageJ.

Il sulforafano è una sostanza chimica della raccolta di isotiocianato di sostanze organosolfuro ottenute da verdure crocifere, tra cui broccoli, cavoli, cavolfiori, cavoli e cavoli, tra gli altri. Il sulforafano viene prodotto quando l'enzima mirosinasi trasforma la glucorafanina, un glucosinolato, nel sulforafano, noto anche come sulforaphane-glucosinolato. I germogli di broccoli e il cavolfiore hanno la più alta concentrazione di glucorafanina o il precursore del sulforafano. Studi di ricerca hanno dimostrato che il sulforafano migliora le capacità antiossidanti dell'organismo umano per prevenire vari problemi di salute. Dr. Alex Jimenez DC, CCST Insight

Sulforafano e suoi effetti su cancro, mortalità, invecchiamento, cervello e comportamento, malattie cardiache e altro

Gli isotiocianati sono alcuni dei composti vegetali più importanti che si possono ottenere nella dieta. In questo video faccio il caso più completo per loro che sia mai stato fatto. Soglia di attenzione breve? Passa al tuo argomento preferito facendo clic su uno dei seguenti punti temporali. Timeline completa di seguito.

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  • 00: 19: 04 - Invecchiamento
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  • 00: 38: 06 - Riassunto finale
  • 00: 40: 27 - Dose

Timeline completa:

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  • 00: 01: 14 - Consumo di verdure crocifere e riduzione della mortalità per tutte le cause.
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  • 00: 40: 27 - Pensieri sulla determinazione di una dose di germogli di broccoli o sulforafano.
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Ringraziamenti

Sciencedirect.com/science/article/pii/S2213231716302750

Come viene prodotto il sulforafano?

Il riscaldamento diminuisce l'attività delle proteine ​​epitelio-magiche e aumenta la formazione di sulforafano nei broccoli

Astratto

Il sulforafano, un isotiocianato dei broccoli, è uno dei più potenti anticancerogeni di derivazione alimentare. Questo composto non è presente nel vegetale intatto, piuttosto è formato dal suo precursore glucosinolato, la glucorafanina, per azione della mirosinasi, un enzima tioglucosidasi, quando il tessuto dei broccoli viene frantumato o masticato. Tuttavia, numerosi studi hanno dimostrato che la resa di sulforafano dalla glucorafanina è bassa e che un analogo del nitrile non bioattivo, il sulforafano nitrile, è il principale prodotto di idrolisi quando il tessuto vegetale viene frantumato a temperatura ambiente. Prove recenti suggeriscono che in Arabidopsis, la formazione di nitrile dai glucosinolati è controllata da una proteina sensibile al calore, la proteina epithiospecifier (ESP), un cofattore non catalitico della mirosinasi. I nostri obiettivi erano esaminare gli effetti del riscaldamento di cimette e germogli di broccoli sulla formazione di sulforafano e nitrile di sulforafano, per determinare se i broccoli contengono attività ESP, quindi correlare i cambiamenti dipendenti dal calore nell'attività ESP, contenuto di sulforafano e bioattività, misurata mediante induzione del enzima di disintossicazione di fase II chinone reduttasi (QR) in coltura cellulare. Il riscaldamento di cimette di broccoli freschi o germogli di broccoli a 60 ° C prima dell'omogeneizzazione aumenta contemporaneamente la formazione di sulforafano e diminuisce la formazione di nitrile di sulforafano. Una significativa perdita di attività ESP è stata parallela alla diminuzione della formazione di nitrile di sulforafano. Il riscaldamento a 70 ° C e oltre ha ridotto la formazione di entrambi i prodotti nei fiori di broccoli, ma non nei germogli di broccoli. L'induzione del QR nelle cellule di epatoma Hepa lclc7 di topo in coltura ha parallelamente l'aumento della formazione di sulforafano.

 

Il preriscaldamento di cimette e germogli di broccoli a 60 ° C ha aumentato significativamente la formazione catalizzata dalla mirosinasi di sulforafano (SF) negli estratti di tessuto vegetale dopo la frantumazione. Ciò è stato associato a una diminuzione della formazione di nitrile di sulforafano (nitrile SF) e dell'attività della proteina epitospecificante (ESP).

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In conclusione, il sulforafano è un fitochimico presente nei broccoli e in altre verdure crocifere. Una quantità incontrollata di ossidanti causata da fattori sia interni che esterni può causare stress ossidativo nel corpo umano che alla fine può portare a una varietà di problemi di salute. Il sulforafano può attivare la produzione di Nrf2, un fattore di trascrizione che aiuta a regolare i meccanismi antiossidanti protettivi che controllano la risposta della cellula agli ossidanti. Lo scopo delle nostre informazioni è limitato ai problemi di salute della colonna vertebrale e della chiropratica. Per discutere l'argomento, non esitate a chiedere al Dr. Jimenez o contattarci a 915-850-0900 .

A cura di Dr. Alex Jimenez

Riferito da: Sciencedirect.com

Discussione aggiuntiva sull'argomento: Dolore alla schiena acuto

Mal di schienaè una delle cause più diffuse di disabilità e di giornate di lavoro perse in tutto il mondo. Il dolore alla schiena si attribuisce alla seconda ragione più comune per le visite mediche, superata solo dalle infezioni delle alte vie respiratorie. Circa l'80% della popolazione sperimenterà dolore alla schiena almeno una volta nella vita. La colonna vertebrale è una struttura complessa composta da ossa, articolazioni, legamenti e muscoli, tra gli altri tessuti molli. Per questo motivo, lesioni e / o condizioni aggravate, come dischi erniciati, può eventualmente portare a sintomi di mal di schiena. Le lesioni sportive o gli incidenti automobilistici sono spesso la causa più frequente di mal di schiena, tuttavia a volte il più semplice dei movimenti può avere risultati dolorosi. Fortunatamente, le opzioni di trattamento alternative, come la cura chiropratica, possono aiutare ad alleviare il mal di schiena attraverso l'uso di aggiustamenti spinali e manipolazioni manuali, in definitiva migliorando il sollievo dal dolore.

EXTRA EXTRA | ARGOMENTO IMPORTANTE: consigliato El Paso, TX Chiropractor

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