Lesioni nervose

Diagnosi delle infezioni del sistema nervoso centrale Parte 2

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Le infezioni del sistema nervoso centrale o del sistema nervoso centrale possono essere pericolose per la vita se non vengono diagnosticate e trattate precocemente. Poiché le infezioni del sistema nervoso centrale non sono specifiche, determinare una diagnosi accurata può essere difficile. I metodi molecolari basati sull'amplificazione in vitro dell'acido nucleico stanno iniziando ad essere utilizzati per la diagnosi microbica di routine. Questi metodi molecolari sono migliorati oltre le tecniche diagnostiche convenzionali con una maggiore sensibilità e specificità. Inoltre, i metodi molecolari utilizzati sui campioni di liquido cerebrospinale sono considerati il ​​nuovo standard per la diagnosi delle infezioni del SNC causate da agenti patogeni.

 

I metodi molecolari per la diagnosi delle infezioni del SNC offrono una varietà di test PCR monoplex e multiplex per diagnosticare diversi tipi di problemi di salute. Le piattaforme molecolari pan-omiche possono anche aiutare a diagnosticare le infezioni del SNC. Sebbene i metodi molecolari siano utilizzati per la diagnosi delle infezioni del SNC, le misure di esito per queste tecniche diagnostiche devono essere attentamente identificate dagli operatori sanitari. Il seguente articolo discute le tecniche diagnostiche convenzionali e i metodi molecolari utilizzati per la diagnosi delle infezioni del sistema nervoso centrale, la loro applicazione e gli approcci futuri.

 

Metodi molecolari nella diagnosi delle infezioni del SNC

 

A causa della maggiore sensibilità e specificità, i metodi molecolari basati sull'amplificazione in vitro dell'acido nucleico hanno notevolmente migliorato la capacità di diagnosticare le infezioni del SNC in un lasso di tempo ragionevole ed efficace. Diverse tecniche derivate dalla PCR hanno infine aumentato la flessibilità e il rigore delle tecniche diagnostiche attualmente disponibili.

 

La trascrittasi inversa, o RT, -PCR è stata sviluppata per aumentare gli obiettivi dell'RNA. Il suo utilizzo gioca un ruolo fondamentale nella diagnosi delle infezioni da virus RNA e nella gestione della loro reazione al trattamento. L'accesso tempestivo alle misure di esito RT-PCR dell'enterovirus ha dimostrato degenze ospedaliere più brevi, ridotto l'utilizzo non necessario di antibiotici e minori valutazioni e test di laboratorio ausiliari. Tecniche di rRNA PCR ad ampio raggio, che utilizzano una singola coppia di primer mirati a regioni di geni conservati, sono state utilizzate per diagnosticare patogeni batterici e virus dell'herpes nel liquido cerebrospinale. Tecniche basate sull'amplificazione isotermica. compresa l'amplificazione isotermica mediata dal loop o LAMP, sono stati sviluppati per offrire una diagnosi entro pochi minuti o ore. La tabella 2 mostra i dispositivi diagnostici molecolari in vitro commerciali, o IVD, che sono stati autorizzati dalla Food and Drug Administration, o FDA, per la diagnosi di patogeni microbici nel CSF.

 

Saggi Monoplex

 

Un metodo molecolare convenzionale prevede tre fasi: estrazione del campione, amplificazione dell'acido nucleico target e rilevamento degli ampliconi. Uno dei primi test molecolari utilizzati con successo per la diagnosi di infezioni del SNC è stato utilizzato per la diagnosi di HSV nel liquido cerebrospinale o CSF. La PCR è diventata il test di scelta quando studi di ricerca hanno dimostrato che la PCR del CSF era simile alla coltura del tessuto cerebrale per la diagnosi di encefalite e meningite da HSV. Molti metodi basati sulla PCR per la diagnosi di herpes e enterovirus sono diventati disponibili con una maggiore sensibilità rispetto alla coltura virale.

 

La PCR in tempo reale con amplificazione degli acidi nucleici e rilevamento degli ampliconi ha ulteriormente migliorato la transizione ai metodi molecolari nei laboratori clinici. A differenza della PCR convenzionale, il sistema in tempo reale è un sistema `` chiuso '' e supera il problema fondamentale della contaminazione da carryover. Al momento della preparazione del manoscritto, tre test molecolari utilizzati per aiutare a diagnosticare l'HSV e gli enterovirus nel CSF sono stati infine approvati dalla FDA, come dimostrato nella Tabella 2 dell'articolo precedente. I metodi basati sulla PCR in tempo reale sono la principale tecnica diagnostica utilizzata per diagnosticare il virus Zika, che è stato segnalato per la prima volta in Uganda nel 1947 ed è ora una preoccupazione mondiale dopo che il virus si è diffuso ampiamente in Brasile e in America centrale. Gli studi di ricerca hanno sviluppato un test RT-PCR in una fase utilizzato per diagnosticare il virus Zika nel siero umano con un rilevamento limitato di 7.7 pfu / reazione. Insieme al plasma, l'RNA del virus Zika può essere diagnosticato attraverso l'urina e il plasma entro le prime 2 settimane dopo la manifestazione dei sintomi. Nel marzo 2016, la FDA ha approvato un test trioplex-PCR con autorizzazione all'uso di emergenza per la diagnosi simultanea di virus Zika, Chikungunya e Dengue nel siero, nelle urine, nel liquido cerebrospinale e nel liquido amniotico. Il test RT-PCR utilizza sonde di idrolisi a doppia etichetta con un LOD di 1.54-10 4 GCE / ml di virus Zika nel siero.

 

L'introduzione di test diagnostici basati sulla PCR in tempo reale ha influito sulla diagnosi precoce ed efficace di numerose infezioni batteriche. I saggi molecolari basati sull'amplificazione isotermica hanno eccellenti caratteristiche prestazionali e non richiedono alcuna attrezzatura specializzata. Questi test sono fondamentali per l'utilizzo di test on o near point-of-care. Metodi basati su LAMP sono stati utilizzati per diagnosticare la meningite da Neisseria, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae di tipo b, M. tuberculosis e JEV nel liquor. Il test Xpert MTB / RIF ha migliorato enormemente la regolazione della tubercolosi offrendo un sistema integrato e automatizzato che consente un rapido processo decisionale clinico in un contesto POC o near-care. Diversi studi di ricerca hanno utilizzato Xpert MTB / RIF per valutare la diagnosi di M. tuberculosis nel CSF da meningite TB. In una meta-analisi di tredici studi di ricerca, la sensibilità aggregata del dosaggio Xpert era dell'80.5%, o 95% CI dal 59.0% al 92.2%, contro la coltura e 62.8%, o 95% CI dal 47.7% al 75.8%, contro lo standard composito . L'utilizzo di un grande volume di campione, di almeno 8-10 ml, è necessario per testare il CSF e la centrifugazione può causare notevoli miglioramenti nella resa. Nonostante la mancanza di standardizzazione per l'elaborazione dei campioni, l'OMS ha consentito di testare il CSF con il saggio Xpert MTB / RIF automatizzato come test di prima linea rispetto alla microscopia convenzionale.

 

Saggi multiplex

 

La semplicità rende i saggi molecolari multiplex fondamentali per la diagnosi di un pannello di bersagli microbici. Sono stati sviluppati diversi test PCR multiplex per diagnosticare patogeni batterici nel liquor che colpiscono le cause più comuni di meningite: S. pneumoniae, N. meningitis, H. influenzae, L. monocytogenes, S. agalactiae, S. aureus, E. coli e M. pneumoniae. Una PCR multiplex seguita dalla serie di sospensioni Luminex può diagnosticare simultaneamente otto patogeni batterici e virali nel CSF, tra cui N. meningite, S. pueumoniae, E. coli, S. aureus, L. monocytogenes, S. agalactiae, HSV-1/2, e VZV, tra gli altri.

 

Considerando la varietà di patogeni coinvolti nell'infezione del SNC, l'applicazione di pannelli molecolari completi con più bersagli batterici e virali ha migliorato l'efficienza della diagnosi. Il pannello BioFire FilmArray Meningitis / Encephalitis è attualmente l'unico test multiplex approvato dalla FDA utilizzato per la diagnosi di sei batteri, come Escherichia coli K1, Haemophilus influenzae, Listeria monocytogenes, Neisseria meningitides, Streptococcus agalactiae e Streptococcus pneumoniae, sette , enterovirus, HSV-1, HSV-2, herpesvirus umano 6 o HHV-6, parechovirus umano e VZV, nonché un singolo fungo, come Cryptococcus neoformans / gattii, bersaglio nel CSF come dimostrato nella Tabella 2. Il FilmArray integrato il sistema impiega circa un'ora, con solo 2 minuti di tempo pratico. Durante la preparazione del manoscritto, due studi di ricerca hanno dimostrato le prestazioni di questo test. Utilizzando 48 campioni di campioni di liquido cerebrospinale gram-negativi da casi sospetti di meningite, studi di ricerca hanno dimostrato che questo sistema ha diagnosticato più patogeni virali, come l'EBV. Quattro casi di WNV e un singolo caso di istoplasma non sono stati diagnosticati con questo test. Tra i pazienti con infezione da HIV in Uganda, le prestazioni del test hanno dimostrato una maggiore sensibilità e specificità per la diagnosi di Cryptococcus. Sebbene il pannello FilmArray Meningitis / Encephalitis offra una rapida diagnosi delle infezioni del SNC, sono necessari ulteriori studi di ricerca per determinarne le prestazioni per una varietà di target e altre popolazioni ad alto rischio.

 

Le coinfezioni si riscontrano frequentemente tra i pazienti immunocompromessi e alla fine possono essere difficili da diagnosticare per i medici. Il design multiplex consente la diagnosi simultanea di più target sullo stesso campione. Uno studio di ricerca ha utilizzato un pannello di test molecolari monoplex e multiplex per condurre uno studio prospettico di ricerca di coorte in Uganda per valutare in modo completo l'eziologia della meningite tra gli adulti con infezione da HIV. Tra i 314 pazienti affetti da HIV con meningite, la co-infezione da EBV è stata diagnosticata con Cryptococcus, M. tuberculosis o altri patogeni virali. L'EBV nel liquido cerebrospinale in questi contesti non è completamente compreso sebbene un singolo studio di ricerca abbia associato un aumento della carica virale dell'EBV come indicatore di misure di esito sfavorevole in pazienti con meningite batterica e co-infezione / riattivazione da EBV, tra gli altri.

 

Saggi molecolari Pan-Omic

 

I miglioramenti tecnologici nel sequenziamento metagenomico profondo hanno aumentato il suo utilizzo per la diagnosi clinica delle infezioni del SNC. Diversi studi di ricerca hanno dimostrato la sua capacità di risolvere problemi di tecnica diagnostica che sfidano i limiti dei tradizionali test di laboratorio. A causa dello stato sterile e della protezione da parte di BBB, il CSF e le biopsie cerebrali sono fondamentali per esplorare ulteriormente l'utilizzo di questa tecnologia per la diagnosi dei patogeni. La metagenomica è stata utilizzata con successo per stabilire una diagnosi di neuroleptospirosi in un ragazzo di 14 anni con immunodeficienza combinata grave che soffriva anche di attacchi ricorrenti di febbre, mal di testa e coma. Allo stesso modo, il sequenziamento dell'RNA ad alto rendimento eseguito sulla biopsia cerebrale di un ragazzo di 18 mesi con encefalopatia ha diagnosticato un nuovo Astrovirus come causa. Nonostante l'utilizzo della metagenomica per la diagnosi di malattie infettive, ci sono molte preoccupazioni tecnologiche e pratiche che devono essere affrontate prima che questa forma di test diagnostico possa diventare mainstream e parte dello standard clinico di cura.

 

Altri progressi promettenti si sono verificati nella trascrittomica, nella proteomica e nella metabolomica. MicroRNA ospite e microbico o miRNA, i profili sono stati utilizzati per una varietà di malattie infiammatorie e infettive. Due miRNA, miR-155 e miRNA-29b, sono stati segnalati come potenziali biomarcatori per l'infezione da JEV e obiettivi di trattamento per la terapia anti-JEV. Il fattore di crescita epidermico neurale dell'ospite, inclusi 2 e apolipoproteina B nel liquor, è stato in grado di diagnosticare la meningite tubercolare con una sensibilità dall'83.3 all'89.3% e una specificità dal 75 al 92%. È stato riportato che il profilo dei metaboliti del CSF è utile nella classificazione, diagnosi, epidemiologia e valutazione del trattamento delle infezioni del SNC nei pazienti HIV. L'analisi del profilo metabolico del liquido cerebrospinale ha dimostrato l'adattamento bioenergetico nella regolazione dei turni dei pazienti con infezione da HIV.

 

Misure di esito associate alle malattie

 

La diagnosi di un agente eziologico in pazienti con infezioni del SNC richiede la considerazione degli organismi causali più comuni, delle tecniche diagnostiche e dei metodi molecolari disponibili per questi agenti e dei campioni clinici a più alto rendimento per la valutazione e il test. La conoscenza dell'epidemiologia e della presentazione clinica di agenti specifici è fondamentale nella selezione dei metodi diagnostici appropriati per i pazienti. Devono essere prese in considerazione l'esposizione ad animali o vettori, l'ubicazione geografica, la storia dei viaggi recenti, la stagione dell'anno, l'esposizione a contatti malati e le esposizioni professionali.

 

Quando si selezionano metodi diagnostici molecolari specifici per patogeni appropriati, è necessario considerare i seguenti fattori. Il CSF è il campione ottimale per il test PCR per i pazienti con meningite o meningoencefalite. Sebbene le prove indirette possano essere determinate testando altri tipi di campioni, è necessario tentare di ottenere campioni di CSF in anticipo prima che il trattamento possa compromettere la resa. Il tempo del test dalla manifestazione dei sintomi è fondamentale per comprendere ed escludere risultati falsi negativi e raccomandare di ripetere il test entro un certo lasso di tempo. Ad esempio, la PCR HSV può comunemente restituire risultati falsi negativi se il campione di CSF viene ottenuto molto presto o tardi nel processo di infezione da HSE. È noto anche che l'integrità dell'host influisce sulle caratteristiche delle prestazioni del test. I pazienti immunocompromessi sono a rischio di infezione da una varietà di agenti patogeni opportunisti, ad esempio HHV-6, virus JC, encefalite da toxoplasma in pazienti sottoposti a trapianto di midollo osseo e pazienti con HIV. Spesso, l'infezione può essere più grave, come il WNV, e difficile da diagnosticare in questa popolazione. La tabella 3 di seguito mostra le raccomandazioni pratiche sull'applicazione e le insidie ​​del test molecolare per la diagnosi delle infezioni del SNC.

 

 

Inoltre, i risultati positivi del test di amplificazione degli acidi nucleici sono considerati complicati dal fatto che alcuni virus sopravvivono latentemente nei macrofagi o nei tessuti neurologici anche se vengono accidentalmente diagnosticati con tecniche molecolari sensibili senza un effettivo ruolo patogeno che può potenzialmente portare a un trattamento eccessivo. L'utilizzo di biomarcatori aggiuntivi che aiutano a determinare la replicazione attiva viene esplorato per superare questo inconveniente negli studi di ricerca.

 

Storicamente, la diagnosi di agenti microbiologici in pazienti con infezioni del SNC è stata ostacolata dalla bassa resa di colture di CSF per organismi batterici virali e esigenti, ritardi nella produzione del SNC di anticorpi specifici per organismi e difficoltà nella determinazione dei campioni ottimali per i test. I metodi e le tecniche di diagnostica molecolare basati sull'amplificazione in vitro degli acidi nucleici hanno un'applicazione più ampia e migliore nella pratica clinica della microbiologia. Il test monoplex sarà probabilmente la piattaforma principale utilizzata per saggi urgenti, ad accesso casuale e a bassa produttività. I dosaggi multiplex hanno l'ulteriore vantaggio di diagnosticare bersagli multipli e infezioni miste. Poiché il volume del campione di CSF recuperato è spesso piccolo, i saggi multiplex consentono un'analisi diagnostica completa con una bassa quantità di campione, eliminando la necessità di ripetute punture lombari. La rilevanza clinica e il rapporto costo-efficacia delle strategie di diagnosi simultanea di più patogeni richiedono ulteriori studi di ricerca. L'applicazione di tecniche pan-omiche nella sfida alla diagnosi delle infezioni del SNC è la nuova entusiasmante frontiera, la tecnologia è promettente ma si prevede che l'implementazione di routine sarà lenta a causa di varie sfide, come la mancanza di linee guida normative applicabili e l'adattamento in ambito clinico, sebbene le misure di risultato sono promettenti.

 

Come accennato in precedenza, il sistema nervoso centrale o il sistema nervoso centrale, le infezioni possono essere pericolose per la salute se non vengono diagnosticate e trattate correttamente. Tuttavia, determinare una diagnosi di infezioni del SNC può essere difficile per molti medici. Fortunatamente, una varietà di tecniche diagnostiche e metodi molecolari alla fine può aiutare a determinare la fonte delle infezioni del SNC e altri problemi di salute. Queste tecniche diagnostiche e metodi molecolari sono notevolmente migliorati nel corso degli anni, come già accennato in precedenza, e molte di queste valutazioni vengono utilizzate in contesti clinici per diagnosticare accuratamente le infezioni del SNC per un trattamento adeguato. - Dr. Alex Jimenez DC, CCST Insight

 

Nella parte 2 del nostro articolo "Diagnosi delle infezioni del sistema nervoso centrale", abbiamo discusso dei metodi molecolari e dei saggi molecolari pan-omici che vengono utilizzati nella diagnosi delle infezioni del sistema nervoso centrale e di come le misure di esito dei test specifici sono state infine associate a cliniche malattie e problemi di salute. Lo scopo delle nostre informazioni è limitato a problemi di chiropratica, salute muscoloscheletrica e nervosa, nonché articoli, argomenti e discussioni di medicina funzionale. Per discutere ulteriormente l'argomento di cui sopra, non esitate a chiedere al Dr. Alex Jimenez o contattarci al numero 915-850-0900 .

 

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